1. Real-time PCR의 기본 개념
Quantitative real time PCR(qRT-PCR)은 1992년에 도입되어 생명공학에 응용되기 시작 하였다. 이 기술은 잘 알려져 있는 PCR 기법을 개량한 것이다. PCR은 핵산의 효소 증폭을 의미하고 있으며, 극히 적은양의 시료를 대량으로 증폭할 수 있다는 장점과 그 과정의 간단함 때문에 생명공학 대부분의 cloninig, sequencing 등의 기본 기술로 응용되었다. 그러나 분석도구로서의 PCR은 결정적인 한계를 가지고 있는데, 증폭된 산물의 정량화가 불가능하다는 점이었다. 즉 , 기하 급수적으로 핵산을 복제하여 증폭하기 때문에 초기에 원래 존재하였던 핵산의 양을 추정하기가 어렵다. 이한계는 1992년 증폭되는 핵산의 양을 정량적으로 핵산물질에 형광을 붙이고 이형광을 지속적으로 검츨하는 방식으로 이루어 진다. 이론적으로 모든 PCR의 증푹은 2n(n=cycle 수) 배울로 증가하기 때문에, 실기산으로 측정된 증폭값으로 수학적 regression을 수행하면 사이클 수에 따라 시료에 존재하였던 초기주형(template) 핵산량을 역으로 추정할 수 있다.
2. Real-time PCR의 정의
Real time PCR법은 PCR 증폭산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 해석하는 기술이다.
기존의 PCR법으로는 측정하기 어려운 정확한 정량이 가능하다. End Point에서 PCR 증폭산물을 확인하는 기존의 PCR법에 비해서 다음과 같은 잇점을 갖고 있다. ① DNA와 RNA의 정확한 정량이 가능하다. ② 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하게 해석할 수 있으며, 오염의 위 험성이 적다.
또한, PCR법을 기본으로 하고 있기 때문에 검출감도가 높고, mRNA발현 해석이나 SNPs typing등의 유전자 해석에 요구되는 필수 기술이다. Real Time PCR의 실험 조작은 비교적 간단하며 종래의 PCR법과 거의 유사하다고 생각하면 된다.
3. End-poing PCR 후에 증폭 산물의 detection 방법의 단점
- 많은 노동력 요구
- 낮은 분석 처리량
- Carryover contamination에 의한 위양성 결과
- (PCR 반응 후, detection을 위해 반응 tube를 열어서 증폭 산물을 분석 시스템으로 옮기는 과정에서 carryover contamination 발생 우려가 높아짐)
- 민감도나 해상도가 낮음
- 초기 투입된 template DNA의 양을 확인 불가
>> Real-time PCR은 위와 같은 단점을 극복하고 Tube가 닫혀있는 상태로 결과를 바로 분석하기 때문에 오염률도 낮고, 조작이 간편하고, 형광검출법으로 신속한 결과를 얻을 수 있으며 민감도와 특이도 높은 정밀한 분석이 가능하다. 또한 Broad한 dynamic range로 정확한 정량이 가능하다. 정성, 정량 분석 가능
4. Real Time PCR의 용도
Real Time PCR법은 유전자 발현 해석 외에 SNP typing, 유전자 조작 식품(GMO) 의 검사, 바이러스나 병원균의 검출, 도입 유전자의 Copy 수 해석 등 다양한 용도 에 응용되고 있다. 유전자 발현 해석과 같은 정량 해석은 Real Time PCR의 가장 기본적인 용도이다. 이외에도 정성적인 분석에도 충분히 활용가능하다. 이것은 Real Time PCR 반응 후에 증폭 산물을 전기 영동으로 확인할 필요가 없어, 간편 하고 신속하게 결과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, contamination의 위험이 낮기 때문이기도 하다. 최근에는 기존의 PCR법으로 검출하던 유전자 검사를 Real Time PCR로 검출하려고 하는 시도가 활발하게 진행되고 있다.
5. Real Time PCR의 원리
PCR의 원리는 온도의 변화만으로 극소량의 DNA를 합성할 수 있다는 점이다. PCR은 DNA를 주형으로 사용하여 72도에서 활동하는 DNA 합성효소의 존재가 가장중요하다. 이효소에 의하여 주형DNA가 복제되어 지기때문이다. 또 다른 중요한 요소는 특정 부위의 증폭에 합당하게 합성된 올리고 뉴클레오타이드가 필요하며 이올리고 뉴클레오타이드의 주형에 적절한 결합(anneal)이다. PCR 증폭에 사용되는 Taq polymerase의 최적 온도는 72도라고 알려져 있고 대부분의 PCR에서 이용되지만, 실제로 이온도보다 더 낮은 온도에서도 작용한다. Real Time PCR은 Taq polymerase의 온도 적응성을 이용하고 있다. 예를 들어,Taq polymerase의 일종인 TaqMan probe의 경우, 60도에서 증폭이 가능하다. 그럼에도 실험실에서는 증폭온도 72도를 사용하여 주형 DNA의 2차구조 형성을 억제하는 것이 유리하다.
Real Time PCR의 또 다른 기술적 고려 사항으로 Primer dimer 형성을 지적할 수 있다. 보통의 Real Time PCR에서 사용하는 증폭DNA의 크기는 매우 짧다(100-250bp). 그래서 PCR에서 Taq polymerase의 증폭을 억제하는 주요한 원인의 하나인 Primer dimer 형성 가능성이 적다. Primer dimer가 문제가 되는 이유는 짧은 올리고뉴클레오타이드가 형성하는 Primer dimer에 의하여 주형 DNA의 증폭과정이 억제되기 때문이다.Primer dimer 형성을 억제하기 위하여 K+이 포함되어 있지 않은 buffer를 사용한다. K+가 G:C-dimer 형성과 함께 주형 DNA의 염기서열 가운데 2차구조를 만드는 부분도 polymerase기능을 억제할 수 있다. 또한 알려진 hair pin 구조가 형성될 때에도 polymerase 증폭 과정을 방해한다.
PCR 산물이 형성되는 상황을 추적하기 위하여 Real Time PCR은 형광물질을 사용한다.
지금까지 몇 종류의 형광물질이 개발되어 있는데, Real Time PCR에서는 산물이 증폭될 때 축적되는 형광물질의 발현양을 검출하는 방식으로 발현양을 정향화 한다. 대부분의 실험에서 형광발현양은 PCR 반응 시간에 따라 점차 축적되다가 어느 순간에 이르러 기하 급수적으로 증가하고, 그다음 포화 상태에 이르는 형태를 보인다. 형광물질 시그날이 포화상태에 이르는 이유는 방응 내 어떤 요소가 모두 소모되기 때문인데, 올리고 뉴클레오타이드, 형광물질 또는 DNTP 일 수 있다. 따라서 Real Time PCR에서 시스널이 포화상태에 이르는 지점에서는 더이상 얻을 수 있는 정보가 없고 이단계에서는 증폭이 성공적이었나 아니었나만을 알 수 있는 all or nothing 결과만 가질 수 있다.
Real Time PCR에서 의미있는 정보는 PCR 특정 사이클 수 값을 의미하는 CT(critical threshold)를 구할 수 있는 단계에서 제공된다. 이는 Real Time PCR 반응에서 기하 급수적으로 산물이 증가하는 단계에 들어가기 직전의 사이클 값을 의미한다. 하지만 이 CT 값은 각 기계마다 다르면 형광물질을 측정하는 정도에 따라 또는 임의로 설정한 threshold값에 따라 달라질 수 있기 때문에 개별 실험에서 얻은 CT 값을 직접 비교하는 것은 의미가 없다. 실제로 의미있는 것은 각 실험의 값을 normalize 한 다음 그 상대적 비율을 비교하는 경우만 해당한다. CT 값을 이용한 초기 유전자 발현양을 측정하는 가장 간단한 수학적 접근은 증폭효율이 100%일때와 그렇지 않을 때를 구분하여 생각해 볼 수 있다. 즉, 100% 증폭 효율일 경우, 아래와 같이 표현된다.
하지만 대부분의 시료에서 PCR증폭 효율은 100%보다 낮으므로 위의 수식은 변경된 Real Time PCR 증폭효율(E)을 감안하여 다음과 같이 변화된다.
PCR 증폭의 효율은 각각의 실험마다 다를 수 있기 때문에 개별실험에서 이를 구하여 실제 초기양을 추정하는 것이 중요하다. 증폭효율을 정하는 방법은 각 시료의 증폭시 시료를 적당한 비율로 희석하여 각 희석 시료의 CT 값을 구하여 로그 스케일로 linear regression을 하는 것으로 구할 수 있다. Real Time PCR의 실험데이터(CT)는 주로 농도에 대한 지수 척도로 표현된다. 특히 2배씩 증가하는 PCR의 특성상 밑수를 2로 표시하지만 그외의 밑수(10또는 자연 로그)를 선택하더라도 같은 결과를 가진다.
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